Bij cisgenese wordt net zoals bij transgenese extra DNA stabiel ingebouwd in planten-DNA. Het verschil is dat bij transgenese sprake is van soortvreemd DNA en bij cisgenese van DNA afkomstig uit een plant waarmee de acceptorplant kan kruisen. Onderzoekers van Plant Research International van WUR pleiten op basis van wetenschappelijke argumenten al bijna vijftien jaar om cisgenese vrij te stellen van de GGO-regelgeving. Daardoor zou commercialisering ervan aanzienlijk sneller en goedkoper kunnen worden.
Hans Tramper is emeritus-hoogleraar Bioprocestechnologie Wageningen Universiteit en reflecteert in een aantal essays op de geschiedenis van zijn vakgebied. Zijn stukken werden tot nu toe gepubliceerd op 18 juni, 30 juni, 11 juli, 22 juli, 19 augustus, 10 september, 21 september, 30 september, 10 oktober, 31 oktober, 8 november, 2 december en 26 december 2018, en 21 april 2019.
Cisgenese: produceert dat wel of niet genetische gemodificeerde organismen (GGOs)?
In 2005 stellen Wageningse plantenveredelaars het Nederlands parlement voor cisgene planten vrij te stellen van GGO-regelgeving. In 2006 publiceren ze hun argumenten in EMBO reports en Nature Biotechnology. De Nederlandse regering verzoekt de Europese Commissie in 2013 om cisgene planten niet als GGO te classificeren omdat ze even veilig zijn als klassiek veredelde planten en kunnen bijdragen aan duurzame productie van voedsel. In feite verschillen ze in niets van dezelfde gewassen als die zijn verkregen door klassieke veredeling, een veel arbeidsintensiever en tijdrovender proces. In Canada is de regelgeving gebaseerd op het product en daar worden ze daarom niet als GGO bestempeld. In Europa daarentegen wel, omdat de regelgeving daar betrekking heeft op het proces waarmee dat product is gemaakt. En dat blijft helaas voorlopig zo bij besluit van het Europese Hof van Justitie op 25 juli 2018. In de VS en Canada is het eerste ‘cisgene’ product sinds kort op de markt, te weten Arctic apples.
Noordpoolappels
In het kader van de nieuwe schijf van vijf maak ik elke morgen voor ons ontbijt flink wat fruit schoon. We moeten ten slotte zo’n 250 gram per persoon per dag ervan eten volgens de nu nieuw-geldende richtlijnen. Meestal zit er ook een geschilde appel bij onze vitaminebom, hoewel ik voor sommige soorten appels allergisch ben, maar die neem ik uiteraard niet. Om het probleem van bruinkleuring voor te zijn, leg ik vooraf een halve limoen klaar. De geschilde appel smeer ik direct in met limoensap en het vruchtvlees blijft er lekker fris uitzien. Klaar is Kees denk ik dan. Neal Carter, oprichter en directeur van het Canadese bedrijf Okanagan Specialty Fruits (OSF), denkt daar heel anders over. Het bedrijf heeft diverse appelrassen zodanig genetisch gemodificeerd dat die appels na het schillen ook zonder limoen- of citroensap hun frisse kleur behouden. Carter heeft ze tot Arctic apples gedoopt en prijst ze onder meer aan met de bewering dat er nu minder weggegooid hoeft te worden. Een leuke en informatieve video op de website van OSF laat een en ander in een notendop zien. ‘We introduce apple genes to turn off PPO-genes that are already present in the apple,’ wordt er gezegd. Op basis hiervan concludeerde ik in mijn C2W-column Noordpoolappels van 13 juni 2016: ‘Omdat het niet om soortvreemde extra genen gaat, is de verwachting, de hoop, dat de consument deze cisgene appels makkelijk zal accepteren, in tegenstelling tot transgene producten die wel soortvreemde genen hebben. De Noordpoolappels zijn niet gemaakt met transgenese maar met cisgenese, dat is de term die voor organismen gebruikt wordt wanneer deze met soorteigen genen gemodificeerd worden, bijvoorbeeld van wilde verwanten.’ Net als ik plakten meerdere media het label cisgeen erop. Bij nader inzien concludeer ik nu dat de benaming cisgeen voorbarig was en kom hier in de laatste paragraaf op terug. Ook heb ik OSF zelf de appels nergens zo zien noemen.
Waardoor verkleuren appels?
Rijpe appels zijn veelal mooie, kleurrijke vruchten. Ze zien er lekker uit en je zou er zo een hap van willen nemen als je ze op de schappen van de supermarkten ziet liggen. Doe je dat dan kleurt de ‘wond’ snel bruin. Ook als je een appel schilt, of als deze beschadigd is, wordt het vruchtvlees bij de meeste soorten appels snel bruin. De drie boosdoeners zijn polyfenolen, zuurstof en het enzym polyfenoloxidase (PPO). In de hele plantencel zit PPO in een ander cel-compartiment dan de polyfenolen, maar zodra de plantencellen kapot gemaakt worden door bijten, snijden of stoten komen de twee bij elkaar en het enzym oxideert de polyfenolen met zuurstof uit de lucht, met verkleuring en smaak- en structuurverlies tot gevolg. Zo’n 40% van het vruchtvlees komt daardoor in de gft-container terecht. Daar komt bij dat de polyfenolen antioxidantia zijn en door de oxidatie die activiteit verliezen waardoor de voedingswaarde vermindert. Dat gebeurt dus niet bij de Arctic appels. Het ligt dus in de lijn der verwachting dat deze appels daardoor minsten zo gezond zijn en dit na schillen ook blijven, maar onderzocht is dit nog niet.
Polyfenoloxidasen (PPOs)
Niet alleen appels maar veel andere plantensoorten hebben PPOs, denk bijvoorbeeld aan aardappels, bananen en avocado’s die aangesneden ook snel verkleuren. De mens is diploïd, dat wil zeggen dat we twee sets van 23 chromosomen hebben, van beide ouders een set. Veel planten hebben meer dan twee sets van hun soort-specifieke chromosomenaantal en worden polyploïd genoemd. Vaak hebben ze daardoor meerdere karakteristieke iso-enzymen in de verschillende soorten organen en weefsels. Iso-enzymen katalyseren dezelfde reactie, maar hebben niet precies dezelfde aminozuurvolgorde, de coderende genen zijn dus niet helemaal hetzelfde. Uit een appel kunnen vier verschillende PPO-genen geïdentificeerd, geïsoleerd en gekloneerd worden; elke appelsoort heeft zijn eigen set. OSF heeft de vorming van PPOs in meerdere appelrassen grotendeels uitgeschakeld door gene silencing met RNA-interferentie (RNAi).
RNA-interferentie
RNAi is een van de processen die men post-transcriptional gene silencing noemt. Het betreft een oeroude alomtegenwoordige biologische reactie op dubbelstrengs RNA (dsRNA). Het is een mechanisme dat organismen weerstand verleent tegen zowel endogene parasieten als exogene pathogene nucleïnezuren; ook reguleert het de expressie van genen. Ongewenste genexpressie wordt ermee voorkomen door boodschapper RNA (mRNA) kapot te knippen. Endogene triggers van RNAi zijn onder andere dsRNA van virale oorsprong of dsRNA voortkomend uit vreemd DNA zoals bijvoorbeeld de ingebrachte appelgenen uit het OSF-genconstruct (zie onder). In 2001 schrijft Sharp in zijn review RNA interference dat dsRNA afgeleid van een verwant maar niet identiek gen gebruikt kan worden om gericht het eigen overeenkomstige gen uit te schakelen. Volgens hem moeten deze verwante genen voor tenminste 90% dezelfde basenparen hebben. Bovendien moeten ze een aaneengesloten stuk, een segment hebben dat identiek aan elkaar is en een aanzienlijke lengte heeft, waarschijnlijk minstens 30-35 baseparen. Hij schrijft ook dat lange dsRNAs actiever zijn dan korte. Volgens Craig Bettenhausen (2013) zijn de door OSF-ingebrachte appelgenen tussen de 300-1800 baseparen lang en vrijwel exacte kopieën van de vier eigen PPOs.
RNAi-mechanisme
Als DNA wordt overgeschreven naar enkelstrengs RNA en als ‘afwijkend’ herkend wordt, vindt ‘opvouwing’ plaats naar haarspeldachtig dsRNA dat RNAi op gang brengt. Een vereenvoudigd model hiervan is gebaseerd op twee stappen die elk gekatalyseerd worden door een ribonuclease (RNase). In de eerste stap wordt dsRNA door een RNAse opgeknipt tot korte segmenten siRNA (short interfering RNA) van 20-25 basenpaarfragmenten. In de tweede stap worden de strengen van deze siRNAs uit elkaar getrokken en een van de strengen geladen in het zogenaamde RNA-induced silencing complex (RISC). Deze geladen strengen binden alle mRNA dat een complementair stuk heeft, dus ook van de eigen PPO-genen in het geval van de Arctic appels. Een tweede RNAse knipt dan dit gebonden mRNA in stukken en voorkomt daarmee dat mRNA als recept voor het betreffende eiwit gelezen kan worden in de ribosomen. Om alle vier de eigen appel-PPO-genen stil te leggen moeten vier verschillende verwante appelgenen (of fragmenten ervan) ingebracht worden. Hiervoor heeft OSF een genconstruct gemaakt.
OSF-genconstruct
OSF heeft het genconstruct gemaakt uitgaande van het Ti-plasmide van Agrobacterium tumefaciens (zie Essay 4.3). Dit plasmide kan hele planten, maar ook plantencellen en -weefsel, binnendringen en een deel ervan, het zogeheten T(ransfer)-DNA-stuk, nestelt zich in het plantengenoom. Het Ti-plasmide kan men uit A. tumefaciens isoleren en dan openknippen met een specifiek restrictie-enzym in de restrictiesite van het T-DNA. Na het openknippen kunnen de oorspronkelijke genen vervangen worden door een ander stuk DNA. Dit kunnen stukken DNA zijn die een plant een nieuwe gewenste eigenschap geven, in het geval van Arctic appels dus uitschakeling van de vorming van PPOs. OSF gebruikte hiervoor standaard moleculairbiologische technieken. In het genconstruct zitten vier verschillende PPO-appelgenen (of fragmenten ervan) die sterk verwant zijn, maar niet helemaal identiek aan de PPO-sets van de appelsoorten waarin OSF de PPO-vorming door RNAi heeft stilgelegd. De schematische weergave is afgeleid uit een figuur in het artikel Engineerd Apples Near Approval van bovengenoemde Bettenhausen. Naast de vier verwante appelgenen zitten er in het T-DNA-stuk van het OSF-genconstruct ook promotors, terminators en een merkergen (zie volgende paragraaf).
Marktgang
OSF vindt zijn oorsprong in Canada, een land met een product-gebaseerde regelgeving wat GGOs betreft. Als de Arctic appels echt cisgeen zouden zijn, zouden ze uitsluitend soortverwant DNA extra hebben. Dat wil zeggen dat ze ook door klassieke veredelingsmethoden zoals kruising gemaakt zouden kunnen worden, zij het met veel meer inspanning en kosten. Het zou tevens betekenen dat het goedkeuringsproces in Canada met betrekking tot voedsel- en milieuveiligheid aanzienlijk eenvoudiger zou zijn. De promotor voor de ingebrachte appelgenen (Figuur) is echter afgeleid van het bloemkoolmozaïekvirus. Ook de nopaline synthase terminators en het nptII merkergen zijn geen appel-DNA. Dit betekent dus dat de Arctic appels zeker niet cisgeen zijn, in tegenstelling tot wat ik eerst dacht. De reguliere GGO-regelgeving is dus ook in Canada van kracht op de Arctic appels.
Het nptII merkergen maakt de plant tolerant tegen het antibioticum kanamycine. NptII is niet alleen de naam van het gen maar ook van het eiwit dat erdoor gecodeerd wordt. Door dat eiwit wordt de plant kanamycine-tolerant. In 1993 al kreeg het nptII van de Amerikaanse FDA de GRAS-status, hetgeen betekent dat het in voedsel gebruikt kan worden zonder specifieke goedkeuring van de FDA. De met het OSF-genconstruct behandelde stukjes appelweefsel werden blootgesteld aan kanamycine waardoor alleen die stukjes die succesvol het T-DNA hadden geïncorporeerd bleven leven. Van de 2000 waren dat er maar tien, volgens OSF-directeur Neal Carter, en in slechts één hiervan werd de PPO-vorming voldoende onderdrukt. Alles bij elkaar kost het naar zijn zeggen zeker tien jaar om van een gewone appel de Arctische variant te maken en die goedgekeurd en op de markt te krijgen, hetgeen niet ongewoon is voor transgene gewassen.
Wel GMO, geen cisgenese
OSF plantte de eerste testappels in 2003. Na negen jaar testen diende OSF in 2012 bij APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) van het USDA (United States Department of Agriculture) het verzoek in tot goedkeuring van twee Arctic appels, te weten een Golden Delicious en een Granny Smith. In 2015 verklaart dit Amerikaanse landbouwministerie dat de risico’s voor mens en milieu verwaarloosbaar zijn. De kans op ongewenste verspreiding wordt nihil geacht en de bomen zijn niet vatbaarder voor ziektes en plagen dan andere. Het is één van de eerste genetisch gemodificeerde fruitbomen waarvan de vruchten voor consumptie goedgekeurd zijn. Alleen op Hawaï zijn er al commerciële transgene papajabomen.
Inmiddels hebben de Arctic appels de Amerikaanse en Canadese markt bereikt in de vorm van voorverpakte schijfjes, vers en gedroogd, de laatste zijn bij Amazon te koop. Vooral in de verse schijfjes zie ik wel enig maatschappelijk nut, opvoedkundig gezien dan. Een hele appel meegeven in het lunchpakket van schoolkinderen heeft vaak tot gevolg dat die heel of half afgeknaagd in de prullenbak belandt. Zo’n pakje lekker fris-uitziende schijfjes als tussendoor snack kan een gezond alternatief zijn en een gewoonte maken van het eten van fruit.
Wat mijzelf betreft – ik ben vooral allergisch voor Granny Smith – is het wachten nu op zo’n appel zonder allergenen, want ik vind deze fris-zure harde appel eigenlijk best lekker. Heerlijk om zo in te bijten, met schil en al. In Nederland, echter, verwacht ik de Arctic appels sowieso nog lang niet op de markt. Zelfs de Wageningse plantenveredelingsonderzoekers die niet alleen met cisgenese een schurftresistente appel hebben ontwikkeld, maar ook een cisgene fytoftoraresistente aardappel, geloven er wat de EU betreft niet erg meer in. Het enige lichtpuntje is dat het in Canada en de VS wel lukt. Het vertrouwen erin dat OSF-directeur Neal Carter uitstraalt, komt vast nog een keer overwaaien naar deze kant. Inmiddels is in september 2016 ook de derde Arctic appel, een Fuji van hetzelfde bedrijf goedgekeurd voor consumptie. En… er zitten er meer in de pijplijn, met vooraan de Gala.
Dank ben ik verschuldigd aan Dr. Henk Schouten, plantenveredelaar bij WUR. Hij hielp me verder toen ik vast zat en leverde opbouwend commentaar bij mijn laatste concept. Ik maakte er graag gebruik van.